澳门大阳城集团2138网站(官方VIP认证)-最新App Store

© 澳门大阳城集团2138网站
客服中心
服务流程
常见问题
下载专区
在线反馈
常见问题 澳门大阳城集团2138网站 > 新闻中心 > 常见问题
1、免疫共沉淀(co-IP)实验思路如何选择?是coIP-WB,还是coIP-MS?

Co-IP(免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation)是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术,能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件,保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、pull down等方法,其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内,保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。

Co-IP实验原理:以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

Co-IP1.png
一般常规思路,如果想鉴定一个蛋白的未知的互作蛋白,可以选择CoIP-MS,用质谱的方法对IP拉下来的产物蛋白进行筛选鉴定。而想鉴定验证两个蛋白在细胞内结合互作,可以采用co-IP与Western blotting联用的方法。


2、Label-free蛋白质组定量检测有哪些好处?

不同于TMT法或iTRAQ法需要稳定同位素标记,非标记(label-free)蛋白质组质谱定量检测的优点就是样品上机前,不需要特殊标记操作,操作非常方便,也节省了标记试剂的费用。我们使用Maxquant软件进行分析,可以做到定量检测。Maxquant软件非标记定量分析是以MS1为基础,然后提取XIC进行定量。实验证明结合Maxquant软件分析的非标记技术具有较好的定量准确性和可靠性。

不可否认,Label-free法也有自身的弱点。Label free定量主要采用DDA采集的一级质谱的信号进行定量,而母离子挑选中受干扰很大,容易造成定量不准。所以我们建议客户做Label free定量法对同一样品至少做三次重复检测。

3、什么是TMT串联质谱标记法?与iTRAQ相比,有什么不同之处?

串联质谱标记(Tandem mass tag,TMT)氨基反应的稳定同位素标签。由于是同质标签(isobaric),多个不同形式的标签带,TMT标记现在最多可以做到10标,也就是说可以同时平行做10个样品的蛋白质谱定量检测。

 

        

        图 1: (a)iTRAQ和 (b)TMT试剂的结构示意图                                           图2:Thermo Scientific TMT试剂– TMT10

 

 

TMT和ITRAQ的本质原理都是等重同位素标签(isobaric mass tags),化学反应原理和用来定量的原理都是相同的。在液质联用分析检测过程中,同质报告标签在二级质谱检测中反映所标记的肽段的分度。TMT和ITRAQ所不同的是化学结构不同,分别有Thermo公司与ABSCIEX公司的商业产品。

       

                              图3: 同质同位素标记法工作流程

参考文献:

TMT法:

Jump up to:a b Thompson A, Schäfer J, Kuhn K, et al. (2003). "Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS". Anal. Chem. 75 (8): 1895–904.

 

XML 地图 | Sitemap 地图