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Cell: 转录因子蛋白相互作用组揭示先天性心脏病的遗传决定因素
时间:2022-03-14   浏览:326次

先天性心脏病(Congenital heart disease, CHD)存在于1%的活产婴儿中,与广泛表达的心脏转录因子(cTF)的突变相关。cTF错义突变能够破坏与其他特定蛋白的相互作用,影响它们的转录协调性影响发育基因程序。GATA4和TBX5作为两个重要的cTF,是最早发现的家族性CHD的单基因病因之一。TBX5和GATA4在整个基因组的DNA上协同相互作用以调节心脏发育,错义突变破坏这些cTF之间或与其他特定辅助因子之间的物理相互作用从而损害转录协同性,并最终导致心脏畸形。因此,在心脏发生过程中鉴定人类GATA4和TBX5(GT)蛋白相互作用物有助于预测蛋白质编码变异对CHD的影响。

2022年2月18日,来自美国格莱斯顿研究所的Deepak Srivastava团队和Katherine S. Pollard团队在Cell杂志上合作发表了一篇题为Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease 的文章,他们利用整合的蛋白组学和人类遗传学方法,剖析人类心脏祖细胞中内源性GATA4和TBX5的蛋白质-蛋白质相互作用,识别携带CHD相关突变的潜在疾病基因,以揭示心脏基因调控的机制。

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为了鉴定hiPSC衍生的心脏祖细胞(CPs)中的GATA4和TBX5蛋白相互作用组(GT-PPI),研究人员使用针对每种内源性cTF的抗体进行亲和纯化和质谱(AP-MS),并利用CRISPR-Cas9生成TBX5或GATA4纯和敲除的hiPSC作为对照,最终确认了272种候选蛋白。为了确认这些蛋白是否有助于预测CHD的遗传风险,作者将它们与先前报道的CHD相关数据进行比对,发现相互作用组种富含来自CHD先证者的从头突变(de novo variants, DNV)蛋白,其中包含20个遗传功能丧失(loss-of-function, LoF)DNV和53个错义DNV,前者多涉及影响心脏畸形的基因,而后者中的大部分先前并未报道与心脏发育或CHD相关。

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                图1-A. Generation of GATA4 and TBX5 protein interactomes in human iPSC-derived cardiac progenitors

通过对野生型(WT)或KO样品进行RNase和DNase处理后的6天 hiPSC 衍生CPs进行3次重复,生成GATA4或TBX5质谱数据,以关注核酸独立相互作用(图1A)。利用建立的蛋白-蛋白相互作用算法SAINTq,将WT AP-MS实验中鉴定的蛋白与相应的KO控制线进行评分,得到WT CPs中GT相互作用子的初始列表。为了进一步严格,SAINTq根据与诱饵蛋白在同一细胞内的核定位和共表达确定的高分相互作用子进行了额外的过滤。与野生型相比,KO细胞中mRNA下调的蛋白被排除(参见STAR方法:相互作用组蛋白的选择)。该方法共获得272个蛋白质,其中包括之前报道的几个GATA4和TBX5相互作用体以及新的相互作用体。其中几个相互作用体的突变先前已被证实与人类或小鼠心脏畸形相关,这突显了这种方法在疾病基因发现方面的潜力(图1B、1C)

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              图1-B,C. GATA4 (B) and TBX5 (C) interacting protein categories 

接下来,研究人员开发了一项为CHD trio全外显子测序数据集定制的工作流程,以计算这53个错义DNV的优先级分数,较高的分数能反映包括心脏高表达、与心脏畸形相关性高、突变对蛋白功能破坏性增加等特征。其中,GLYR1能通过核小体去甲基化参与染色质修饰和基因表达调控,它的错义DNV为β-羟基酸脱氢酶结构域内的496位点高度保守的脯氨酸被亮氨酸所取代(P496L),该突变引起GLYR1该结构域的刚性增加,破坏与GATA4的物理相互作用。如果共表达野生型GLYR1和GATA4则能将Nppa-荧光素酶报告基因活性提高约15倍,若表达GLYR1突变体则能减弱活性。

为了研究GATA4-GLYR1在CPs中的共占性,研究人员在ChIP-seq后,将GLYR1在心脏祖细胞中募集的基因与在GLYR1所在基因窗口内与GATA4结合的基因进行比较,可以发现两者结合基因体的显着重叠,且与单独与两种基因分别结合的基因相比,重叠组中富集与心脏发育相关的GO term。为了直接评估GATA4和GLYR1是否调节它们共同占据的基因的转录,研究人员通过RNA-seq分析在分别沉默这两种基因后对心脏祖细胞中基因表达的影响,结果显示两者结合的基因在分别被siRNA敲低后显着下调约7倍。

接下来,研究人员利用CRISPR-Cas9构建包含纯和GLYR1 P496L和GLYR1 KO的hiPSC细胞系。与野生型细胞相比,GLYR1 KO引起多能性和细胞周期基因表达降低,肿瘤抑制基因和凋亡基因上调,而GLYR1 P496L中不存在上述变化。然而,在对GLYR1 P496L细胞进行心肌细胞的诱导分化过程中,P496L变体影响GLYR1的占有率和由GATA4共同结合的一组离散靶基因的转录调控,其中一些与人类心脏畸形和心肌病有关。

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总的来说,这项研究证实了GLYR1变体和GATA4-GLRY1相互作用在心脏发育中的重要性,通过组织和疾病特异性的蛋白间相互作用部分克服了CHD的遗传异质性,有助于了解疾病中从头错义突变的潜在影响。这种方法经过适当修改也可以用于了解其他遗传类疾病的遗传基础。

原文链接:

Barbara et. al. Transcription factor protein interactomes reveal genetic determinants in heart disease. Volume 185, Issue 5, 3 March 2022, Pages 794-814.e30

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.01.021



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